Genetische und funktionelle Untersuchungen zum Microphthalmia with linear skin defects (MLS)-Syndrom

Das MLS (microphthalmia with linear skin defects)-Syndrom ist eine seltene, X-chromosomal erbliche, neurokutane Entwicklungsstörung, die sich in der Regel im weiblichen Geschlecht manifestiert und mit in utero-Letalität bei männlichen Individuen einhergeht. Neben linearen Hautdefekten im Gesichts- und Halsbereich, Mikrophthalmie und Sklerokornea werden weitere klinische Merkmale, wie z. B. Zwerchfellhernie, fakultativ beobachtet. Die bekannten Krankheitsgene HCCS, COX7B und NDUFB11, in denen heterozygote Mutationen gefunden wurden, kodieren für Untereinheiten mitochondrialer Atmungs-kettenkomplexe. Bisherige Befunde legen eine beeinträchtigte Assemblierung und Aktivität der Atmungskettenkomplexe in HCCS-, COX7B- und NDUFB11-defizienten Zellen nahe. Diese Zellen zeigen ein erhöhtes Zellsterben, was in hccs-defizienten Zellen in Medaka durch eine Apoptosom-unabhängige Aktivierung der Caspase-9, die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) getriggert wird, erfolgt.
In der zweiten Förderperiode wollen wir uns Arbeitsschwerpunkten widmen, die zur weiteren Aufklärung der genetischen Grundlagen und der Pathomechanismen des MLS-Syndroms beitragen. Durch die Sequenz- und Kopienzahlanalyse des HCCS-Gens bei Patienten mit kongenitaler Zwerchfellhernie wollen wir der Frage nachgehen, ob HCCS-Mutationen mit einer isolierten Form der Zwerchfellhernie in Zusammenhang stehen. HCCS-Varianten werden in einem Hefe-Komplementationsassay hinsichtlich einer Beeinträchtigung der mitochondrialen Atmungskette über-prüft. Mittels Exom-Sequenzierung bei sechs Patienten mit MLS-Syndrom-ähnlichem Phänotyp und deren gesunden Eltern wollen wir neue Krankheitsgene finden. Funktionelle Studien zur Bestätigung der Pathogenität einer singulären Variante bzw. Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Genvarianten sollen Einblicke in die Pathophysiologie geben. Durch unsere bisherigen Exom-Sequenzierungen deckten wir bei einem Patienten mit typischen Merkmalen des MLS-Syndroms die Variante p.(A217V) im X-chromosomalen HDAC6-Gen, das für die Histon-Deacetylase 6 kodiert, auf. Wir wollen in Patienten- und Kontrollfibroblasten die HDAC6-Deacetylase-Aktivität und Protein-Protein-Interaktionen biochemisch untersuchen. Die Auswirkungen der HDAC6-Variante auf das Zellsterben und die Funktionstüchtigkeit der mitochondrialen Atmungskette werden mittels Annexin V-Färbung, ROS-Konzentrationsbestimmung, Untersuchung des mitochondrialen Membranpotentials, Ausschleusung von Cytochrom c in das Cytosol und Aktivitätsbestimmung von Caspasen analysiert. Analoge Experimente sollen mit stabilen, NDUFB11-defizienten HeLa-Zellen durchgeführt werden. Mit der Generierung von Zebrafisch-Morphanten bzw. -Mutanten (CRISPR-Cas9) für cox7b und ndufb11 werden in-vivo-Modelle für das MLS-Syndrom hergestellt, um Entwicklungsdefekte aufzudecken und zu charakterisieren. An Zebrabärblingen werden auch die Einflüsse des jeweiligen Gendefektes auf Zellsterben, Zellproliferation und die oxidative Phosphorylierung analysiert.