Zelluläre Komposition, Ultrastruktur, Genexpression und Dynamik humaner in vitro-reorganisierter adulter Hodenzellen

TY - JOUR

T1 - Zelluläre Komposition, Ultrastruktur, Genexpression und Dynamik humaner in vitro-reorganisierter adulter Hodenzellen

AU - von Kopylow, Kathrein

AU - Schulze, Wolfgang

AU - Salzbrunn, Andrea

AU - Schaks, Matthias

AU - Schäfer, Elke

AU - Schlatt, Stefan

AU - Roth, Beate

AU - Spiess, Andrej-Nikolai

PY - 2017/12

Y1 - 2017/12

N2 - Fragestellung:Ist eine in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen aus aggregatfreien Zellsuspensionen, die aus kleinen TESE-Biopsien hergestellt wurden, sowie die Langzeit-Zellkultur der reorganisierten Zellen in einem einfachen matrixfreien 2D-System möglich und reproduzierbar? Können die Zellen innerhalb der reorganisierten Formationen anhand morphologischer und mit Hilfe von Genexpressions-Analysen identifiziert werden?Hintergrund:In Zellkultur reorganisierte Hodenzellen könnten die Basis für eine in vitro-Spermatogenese sein, eine geeignete Umgebung zur Vermehrung von Spermatogonien / spermatogonialen Stammzellen darstellen sowie Erkenntnisse für die andrologische Grundlagenforschung liefern, und damit insgesamt zur Behandlung männlicher Infertilität beitragen. Morphogenetische Dynamiken von in vitro-kultivierten Testiszellen sind schon seit längerem aus Nagerstudien bekannt, wobei die hier entstandenen Zellaggregate sowohl somatische Hodenzellen, als auch frühe Keimzellen enthielten (Gassei et al., 2008; Pan et al., 2013; Yokonishi et al., 2013; Mäkelä et al., 2014; Zhang et al., 2014; Alves-Lopes et al., 2017). Neuere Studien mit in 3D-Systemen kultivierten humanen Hodenzellen (Baert et al., 2017; Pendergraft et al., 2017) belegen, dass diese Zellen ebenfalls die Fähigkeit besitzen, testikuläre Organoide zu bilden.Methodik:Aggregatfreie Zellsuspensionen aus jeweils zwei 30 mg-Biopsien pro Patient von Patienten mit unterschiedlichem Spermatogenesestatus (vollständige Spermatogenese, Hypo-spermatogenese, Meiose-Arrest, gemischte Atrophie oder Sertoli-cell-only-Syndrom) wurden bis zu 90 Tage in DMEM-Zellkulturmedium unter Zugabe von KO SR und den Cytokinen FGFa (FGF1), FGFb (FGF2), FGF9, GDNF, EGF und IGF in unbeschichteten Plastik-Zellkulturschalen bei 35°C und 5% CO2 in Kultur genommen. Die entstandenen Hodenzellaggregate (Cluster) wurden hinsichtlich ihrer zellulären Zusammensetzung mittels Semidünnschnitt-Technik, Transmissionselektronenmikroskopie, qPCR und Immun-fluoreszenzfärbungen untersucht. Des Weiteren dienten time lapse-Experimente zur Untersuchung der Cluster-Dynamik. Ergebnisse:Die Zellkulturexperimente zeigten, dass die Fähigkeit zur in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen unabhängig vom Spermatogenese-Status des Patienten ist. Die zelluläre Zusammensetzung der entstandenen Formationen spiegelte jedoch in hohem Ausmaß den Zustand im Hoden des jeweiligen Patienten wider. Detektierte Zelltypen in und um die Cluster waren Sertolizellen, peritubuläre Myoidzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Leydigzellen, Makrophagen, Spermatiden und einige Spermatogonien. Cluster-Fusion und die damit zusammenhängende Cluster-Vergrößerung konnte durch time lapse-Aufnahmen belegt werden. Außerdem konnte die Formation der Hodenzell-Cluster durch die Zugabe eines Tyrosin-Protein-Kinase-Inhibitors (K252a) spezifisch gehemmt werden.Schlussfolgerung: Eine in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen in einfachen 2D-Zellkultursystemen ist möglich und hoch reproduzierbar. Die Analyse der zellulären Zusammensetzung der Hodenzellcluster sowie der zellulären Morphologie kann zur weiteren Optimierung solcher Systeme beitragen. Referenzen: Alves-Lopes et al., 2017, Biomaterials 130: 76-89.Baert et al., 2017, Stem Cell Reports 8: 1-9.Gassei et al., 2008, Reprod 136(4): 459-469.Mäkelä et al., 2014, PLoS One 9(3): e90088.Pan et al., 2013, PLoS One 8(3): e60054.Pendergraft et al., 2017, Biol Reprod 96(3): 720-732.Yokonishi et al., 2013, Biol Reprod 89(1): 15.Zhang et al., 2014, Gen Comp Endocrinol 205: 121-132.

AB - Fragestellung:Ist eine in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen aus aggregatfreien Zellsuspensionen, die aus kleinen TESE-Biopsien hergestellt wurden, sowie die Langzeit-Zellkultur der reorganisierten Zellen in einem einfachen matrixfreien 2D-System möglich und reproduzierbar? Können die Zellen innerhalb der reorganisierten Formationen anhand morphologischer und mit Hilfe von Genexpressions-Analysen identifiziert werden?Hintergrund:In Zellkultur reorganisierte Hodenzellen könnten die Basis für eine in vitro-Spermatogenese sein, eine geeignete Umgebung zur Vermehrung von Spermatogonien / spermatogonialen Stammzellen darstellen sowie Erkenntnisse für die andrologische Grundlagenforschung liefern, und damit insgesamt zur Behandlung männlicher Infertilität beitragen. Morphogenetische Dynamiken von in vitro-kultivierten Testiszellen sind schon seit längerem aus Nagerstudien bekannt, wobei die hier entstandenen Zellaggregate sowohl somatische Hodenzellen, als auch frühe Keimzellen enthielten (Gassei et al., 2008; Pan et al., 2013; Yokonishi et al., 2013; Mäkelä et al., 2014; Zhang et al., 2014; Alves-Lopes et al., 2017). Neuere Studien mit in 3D-Systemen kultivierten humanen Hodenzellen (Baert et al., 2017; Pendergraft et al., 2017) belegen, dass diese Zellen ebenfalls die Fähigkeit besitzen, testikuläre Organoide zu bilden.Methodik:Aggregatfreie Zellsuspensionen aus jeweils zwei 30 mg-Biopsien pro Patient von Patienten mit unterschiedlichem Spermatogenesestatus (vollständige Spermatogenese, Hypo-spermatogenese, Meiose-Arrest, gemischte Atrophie oder Sertoli-cell-only-Syndrom) wurden bis zu 90 Tage in DMEM-Zellkulturmedium unter Zugabe von KO SR und den Cytokinen FGFa (FGF1), FGFb (FGF2), FGF9, GDNF, EGF und IGF in unbeschichteten Plastik-Zellkulturschalen bei 35°C und 5% CO2 in Kultur genommen. Die entstandenen Hodenzellaggregate (Cluster) wurden hinsichtlich ihrer zellulären Zusammensetzung mittels Semidünnschnitt-Technik, Transmissionselektronenmikroskopie, qPCR und Immun-fluoreszenzfärbungen untersucht. Des Weiteren dienten time lapse-Experimente zur Untersuchung der Cluster-Dynamik. Ergebnisse:Die Zellkulturexperimente zeigten, dass die Fähigkeit zur in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen unabhängig vom Spermatogenese-Status des Patienten ist. Die zelluläre Zusammensetzung der entstandenen Formationen spiegelte jedoch in hohem Ausmaß den Zustand im Hoden des jeweiligen Patienten wider. Detektierte Zelltypen in und um die Cluster waren Sertolizellen, peritubuläre Myoidzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Leydigzellen, Makrophagen, Spermatiden und einige Spermatogonien. Cluster-Fusion und die damit zusammenhängende Cluster-Vergrößerung konnte durch time lapse-Aufnahmen belegt werden. Außerdem konnte die Formation der Hodenzell-Cluster durch die Zugabe eines Tyrosin-Protein-Kinase-Inhibitors (K252a) spezifisch gehemmt werden.Schlussfolgerung: Eine in vitro-Reorganisation primärer humaner Hodenzellen in einfachen 2D-Zellkultursystemen ist möglich und hoch reproduzierbar. Die Analyse der zellulären Zusammensetzung der Hodenzellcluster sowie der zellulären Morphologie kann zur weiteren Optimierung solcher Systeme beitragen. Referenzen: Alves-Lopes et al., 2017, Biomaterials 130: 76-89.Baert et al., 2017, Stem Cell Reports 8: 1-9.Gassei et al., 2008, Reprod 136(4): 459-469.Mäkelä et al., 2014, PLoS One 9(3): e90088.Pan et al., 2013, PLoS One 8(3): e60054.Pendergraft et al., 2017, Biol Reprod 96(3): 720-732.Yokonishi et al., 2013, Biol Reprod 89(1): 15.Zhang et al., 2014, Gen Comp Endocrinol 205: 121-132.

M3 - Konferenz-Abstract in Fachzeitschrift

VL - 14

SP - 233

EP - 234

JO - J Reprodmed Endokrinol

JF - J Reprodmed Endokrinol

SN - 1810-2107

IS - 5

ER -