Einzelzellmarkierung und -isolierung potenzieller humaner spermatogonialer Stammzellen

TY - JOUR

T1 - Einzelzellmarkierung und -isolierung potenzieller humaner spermatogonialer Stammzellen

AU - von Kopylow, Kathrein

AU - Spiess, Andrej-Nikolai

AU - Schulze, Wolfgang

PY - 2014/9/18

Y1 - 2014/9/18

N2 - Einleitung: Humane spermatogoniale Stammzellen (hSSCs) könnten therapeutisch eingesetzt werden. Um unkalkulierbare Effekte bei einer medizinischen Anwendung, aber auch bei einer In-vitro-Vermehrung der Zellen einzugrenzen, ist die hochreine Isolierung der Zielzellpopulation ohne somatische Kontaminationen unumgänglich. Einen potenziellen Marker für hSSCs stellt der bei nicht-differenzierenden A-Spermatogonien (SPG) vorkommende Oberflächenrezeptor FGFR3 (Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 3) dar [von Kopylow et al., 2010; 2012a; 2012b], mit dem SPG spezifisch isoliert werden könnten. Methodik: Wir haben eine Methode entwickelt, mit der die FGFR3-positiven SPG aus einer reiskorngroßen Hodenbiopsie unter Einsatz eines FACS-Antikörpers gegen FGFR3 (mouse monoclonal IgG #MAB766, R&D Systems) zuerst markiert und danach durch magnetische Zellisolierung mittels Dynabeads ® (Invitrogen Dynal AS) angereichert werden. Die Bead-gebundenen Zellen werden dann aus der Positivfraktion einzeln mit einem Mikromanipulator gepickt. Die Analyse der isolierten Zellen erfolgte durch immunhistochemische Färbung (IHC) gegen den Pluripotenzmarker UTF1 (Undifferentiated embryonic cell Transcription Factor 1) und Lebend-Tot-Färbung. Ergebnisse: Mit der beschriebenen Methode wird eine 100%ige Anreicherungsquote der FGFR3-positiven SPG ohne somatische oder jegliche andere zelluläre Kontamination erreicht. Auf diese Weise kann in der Zellkultur z. B. die ungewollte Differenzierung der potenziellen Stammzellen verhindert werden [Kanatsu-Shinohara & Shinohara, 2013]. Mit Hilfe der IHC-Färbung konnten wir nachweisen, dass die Zellen eine nukleäre Markierung mit UTF1 aufweisen. Dies demonstriert die Isolation richtigen Zellpopulation, da bekannt ist, dass FGFR3 und UTF1 in den gleichen humanen spermatogonialen Zellen exprimiert werden [von Kopylow et al., 2012b]. Die Ergebnisse der Lebend-Tot-Färbung zeigen, dass die Zellen vital sind. Schlussfolgerung: In der derzeitigen Praxis mangelt es an methodischen Ansätzen zur Isolierung reiner hSSC-Populationen ohne somatische Kontaminationen. Die von uns entwickelte Methode zur Isolierung von FGFR3-positiven SPG liefert eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz von hSSCs, die beispielsweise prepubertären männlichen Patienten, die noch keine eigenen Spermien besitzen, nach erfolgreicher Krebstherapie retransplantiert werden könnten. Außerdem stellen die Zellen potenzielles Ausgangsmaterial für eine In-vitro-Spermatogenese oder die regenerative Medizin dar. Des Weiteren können sie zur Grundlagenforschung, z. B. zur Aufklärung des Mechanismus der humanen Spermatogoniogenese, verwendet werden. Grants: Supported by DFG (FOR 1041)

AB - Einleitung: Humane spermatogoniale Stammzellen (hSSCs) könnten therapeutisch eingesetzt werden. Um unkalkulierbare Effekte bei einer medizinischen Anwendung, aber auch bei einer In-vitro-Vermehrung der Zellen einzugrenzen, ist die hochreine Isolierung der Zielzellpopulation ohne somatische Kontaminationen unumgänglich. Einen potenziellen Marker für hSSCs stellt der bei nicht-differenzierenden A-Spermatogonien (SPG) vorkommende Oberflächenrezeptor FGFR3 (Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 3) dar [von Kopylow et al., 2010; 2012a; 2012b], mit dem SPG spezifisch isoliert werden könnten. Methodik: Wir haben eine Methode entwickelt, mit der die FGFR3-positiven SPG aus einer reiskorngroßen Hodenbiopsie unter Einsatz eines FACS-Antikörpers gegen FGFR3 (mouse monoclonal IgG #MAB766, R&D Systems) zuerst markiert und danach durch magnetische Zellisolierung mittels Dynabeads ® (Invitrogen Dynal AS) angereichert werden. Die Bead-gebundenen Zellen werden dann aus der Positivfraktion einzeln mit einem Mikromanipulator gepickt. Die Analyse der isolierten Zellen erfolgte durch immunhistochemische Färbung (IHC) gegen den Pluripotenzmarker UTF1 (Undifferentiated embryonic cell Transcription Factor 1) und Lebend-Tot-Färbung. Ergebnisse: Mit der beschriebenen Methode wird eine 100%ige Anreicherungsquote der FGFR3-positiven SPG ohne somatische oder jegliche andere zelluläre Kontamination erreicht. Auf diese Weise kann in der Zellkultur z. B. die ungewollte Differenzierung der potenziellen Stammzellen verhindert werden [Kanatsu-Shinohara & Shinohara, 2013]. Mit Hilfe der IHC-Färbung konnten wir nachweisen, dass die Zellen eine nukleäre Markierung mit UTF1 aufweisen. Dies demonstriert die Isolation richtigen Zellpopulation, da bekannt ist, dass FGFR3 und UTF1 in den gleichen humanen spermatogonialen Zellen exprimiert werden [von Kopylow et al., 2012b]. Die Ergebnisse der Lebend-Tot-Färbung zeigen, dass die Zellen vital sind. Schlussfolgerung: In der derzeitigen Praxis mangelt es an methodischen Ansätzen zur Isolierung reiner hSSC-Populationen ohne somatische Kontaminationen. Die von uns entwickelte Methode zur Isolierung von FGFR3-positiven SPG liefert eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz von hSSCs, die beispielsweise prepubertären männlichen Patienten, die noch keine eigenen Spermien besitzen, nach erfolgreicher Krebstherapie retransplantiert werden könnten. Außerdem stellen die Zellen potenzielles Ausgangsmaterial für eine In-vitro-Spermatogenese oder die regenerative Medizin dar. Des Weiteren können sie zur Grundlagenforschung, z. B. zur Aufklärung des Mechanismus der humanen Spermatogoniogenese, verwendet werden. Grants: Supported by DFG (FOR 1041)

M3 - Konferenz-Abstract in Fachzeitschrift

VL - 11

SP - 189

JO - J Reprodmed Endokrinol

JF - J Reprodmed Endokrinol

SN - 1810-2107

IS - 4

M1 - FV1

ER -