LO 2291/1-1 Nanobody-unterstützte Strukt

Project: Research

graph of relations

Participants

  • Löw, Mirjam (principal investigator)

Bibliographical data

Description

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 3110600034

ADP-ribosyltransferasen (mit Diphteria-Homologie, ARTDs) transferieren ADP-Ribose von Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) auf Akzeptorproteine und regulieren dadurch zahlreiche zelluläre Prozesse, wie DNA-Reparatur, Entzündungsreaktionen und Apoptose. ARTD4, eine von 17 humanen ARTD-Isoformen, hat eine besonders auffällige Struktur: Auf die katalytische Domäne von ARTD4 folgen >1.000 Aminosäuren mit drei distinkten Proteindomänen, die nicht in anderen Familienmitgliedern gefunden werden. In Zellen taucht ARTD4 im Komplex mit gigantischen 13MDa Ribonukleoproteinpartikeln, sog. Vaults, und in freier, ungebundener Form auf. Vaults werden immer wieder mit Arzneimittelresistenzen in Verbindung gebracht. Das Ziel des beantragten Projekts ist ARTD4 mit Hilfe von spezifischen Nanobodies zu charakterisieren, da bis dato weder seine Struktur, noch seine subzellularen Dynamiken, noch seine Funktion verstanden wird. Nanobodies -Einzeldomänen-Antikörper abgeleitet von Schwereketten-Antikörpern aus Lamas - sind neue experimentelle Werkzeuge für Struktur- und Funktionsstudien, als Aktivitätsmodulatoren und zum Verfolgen von Proteinen in lebenden Zellen. ARTD4-spezifische Nanobodies werden generiert und als Kristallisationschaperone eingesetzt. Konjugiert an Beads sollen sie ARTD4 und ARTD4-assoziierte Proteine immunopräzipitieren. Ein etablierter ADP-Ribosylierungsassay wird genutzt um ARTD4-Substratproteine zu detektieren und um ARTD4-antagonistische Nanobodies zu erkennen. ARTD4-Substratproteine und -Bindungspartner werden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Um die Expression von ARTD4 mit FACS und Immunofluoreszenz zu untersuchen, werden die Nanobodies mit Fluorochromen konjugiert. Desweiteren werden Expressionsvektoren für Nanobody-GFP-Fusionproteine in Zellen transfiziert um die zelluläre Lokalisation und die Dynamik von ARTD4 zu beobachten. Die Ergebnisse unseres Projekts werden helfen, die Rolle von ARTD4 zu verstehen und mit diesem Wissen neue Strategien gegen Arzneimittel-Resistenzen zu entwickeln.
StatusFinished
Effective start/end date01.08.1631.07.19