Adaptive lysosomale Signalwege in CLN3-defizienten Zellen

Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323732846

Teilprojekt zu FOR 2625: Mechanismen der Lysosomalen Homöostase

Mutationen im CLN3 Gen verursachen eine tödlich verlaufende neurodegenerative lysosomale Speicherkrankheit, die durch Defekte des polytopen lysosomalen Membranproteins CLN3 verursacht wird. Die Funktion von CLN3 ist ist bisher nicht bekannt. Wie Zellen lysosomale Funktionen kontrollieren und sich an pathologische Prozesse wie die Akkumulation lysosomalen Speichermaterials adaptieren, ist unklar und unerforscht. Neue Untersuchungen zeigen jedoch, dass die Biogenese der Lysosomen und Autophagieprozesse einer globalen Regulation der Transkription unterliegen, in dem der Transkriptionsfaktor EB (TFEB) eine Schlüsselrolle spielt. Die transkriptionelle Aktivität von TFEB selbst wird durch Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungs-Prozesse reguliert, an denen mTORC1 und ERK1/2 Kinasen bzw. die Phosphatase Calcineurin beteiligt sind und die die Translokation von TFEB in den Zellkern beeinflussen. Vorarbeiten zeigen, dass i) TFEB posttranslational an mehreren Stellen modifiziert wird, was zu >30 Isoformen führt, ii) die Ko-Expression der ERK1/2-inaktivierenden dual specificity phosphatase 2 (DUSP2) in einer schnellen Translokation von TFEB in den Kern resultiert, iii) die Konzentration von ~60% aller lysosomalen Enzyme, besonders Lipid-abbauender Hydrolasen, in zerebellären Zellen von CLN3 knock-in (ki) Mäusen reduziert ist, was mit erniedrigten mRNA Spiegeln korreliert, und iv) die nachfolgenden Änderungen in der Lipidzusammensetzung der Membranen mit veränderten mTORC1 und AKT-Signaltransduktionswegen in CLN3 ki-Zellen in Zusammenhang stehen. Die Ziele des vorliegenden Antrages sind auf die Identifizierung kombinatorischer Modifizierungen (Phosphorylierung und Acetylierung) gerichtet, die die Expression individueller TFEB-Isoformen bedingen. Weiterhin möchten wir herausfinden, ob Aminosäure-spezifische Modifikationen (Acetylierung und Sumoylierung) mit der transkriptionellen Aktivierung bestimmter lysosomaler Gene korrelieren. Zudem beabsichtigen wir, die Rolle der erniedrigten sauren Lipase (LIPA) Spiegel für den lysosomalen Lipidabbau und das Lipidom in CLN3 ki-Zellen durch exogenen Enzymersatz oder durch Aktivierung des AKT-Kinase kontrollierten, LIPA-spezifischen Transkriptionsfaktor FoxO1 zu untersuchen, sowie mögliche lipid-vermittelte lysosomale Signalwege zu analysieren. Schließlich planen wir, das lysosomale Ubiquitinom zu bestimmen, um die Bedeutung des Ubiquitin-abhängigen, selektiven Abbaus von lysosomalen Membranproteinen auf lysosomale Funktionen und Signalwege in CLN3 ki-Zellen einschätzen zu können. Unsere Befunde werden uns neue Einsichten in grundlegende Mechanismen der TFEB-Spezifität für lysosomale Zielgene und adaptive Prozesse in CLN3-defizienten Zellen vermitteln.